김명은, 이창석* | 서울여자대학교 화학과, cslee.chem@swu.ac.kr
서 론
반도체성 단일벽 탄소나노튜브(semiconducting sin- gle-walled carbon nanotube, s-swCNT)는 우수한 물리적 특성(높은 전도성, 넓은 부피-대-표면적, 열적 안정성 등)과 화학적 특성(손쉬운 대량 합성, 풍부한 π-전자 를 이용한 쉬운 기능화, 화학 안정성 등)을 갖고 있어, 전계 효과 트랜지스터(field-effect transistor, FET)의 소재 물질로 꾸준한 사랑을 받으며 사용되고 있다. 이러한 우 수성으로, s-swCNT FET는 전자기기, 바이오센서, 에너지 저장/전환, 양자컴퓨터와 같은 다양한 분야에서 활 용되고 있다. 특별히, 바이오센서의 응용에서는 높은 민감도(sensitivity)와 선택성(selectivity), 짧은 반응 시 간, 비표지 방식(label-free) 측정 등의 강점을 갖고 있다. 그럼에도 불구하고, 우리의 일상생활에서 s-swCNT FET를 활용한 바이오센서는 만나보기 어려운 것이 현실이다. 그 대표적인 두 가지 이유로는 (1)s-swCNT FET 제작의 균일성(uniformity)을 확보하는 것이 어렵기 때문, (2)바이오센서의 신호 경향성의 무작위성(randomity)이 있다. 최근 연구에서는 이러한 단점들을 극복하기 위한 다양한 노력들이 진행되고 있다. 이 글에서는 s- swCNT FET 기반 바이오센서의 신호 변화 경향성을 일 정하게 하기 위한 노력으로, 바이오 수용체의 방향성과 3차원 구조변화가 일으키는 반도체 신호변화 사이의 상관 관계를 알아보는 연구들을 소개하고자 한다.
본 론
1. 탄소나노튜브 전계효과 트랜지스터 기반 전기화학 바이오센서 작동 메커니즘
전기화학 바이오센서는 크게 3개의 부위(분석물질, 수용 체, 신호변환기)로 구성되어 작동한다. 이때, s-swCNT FET는 신호변환기로 사용되는데, 분석물질인 생체재료 (DNA, 단백질, 효소 등)와 바이오 수용체 사이의 인식반응 (biological binding event)을 우리가 알아볼 수 있는 전기 신호로 변환시켜주는 역할을 한다. 이때, 트랜지스터 소자의 전기신호는 (1)쇼트키 장벽(Schottky barrier)의 변화, (2)전하를 띈 입자로 인한 게이트 효과(charged molecu- lar gating effect)에 영향을 받아 변화한다. 대부분의 분석물질과 바이오 수용체의 인식반응은, 위의 두 가지 요인 에 의해 FET 소자의 전기 신호를 변화시키기 때문에, 이전의 연구에서는 이러한 현상에 대해 자세히 다루지 않았다.[참고문헌 1]최근에는 나노바이오인터페이스(nanobiointerface)에 대한 깊은 이해와 다양한 분석기술의 발전, 컴퓨터 시뮬레이션의 응용으로, 분석물질, 바이오 수용체, FET 신호변화의 상관관계에 대해 알아보는 연구들이 발표되고 있다.
2. 항원-항체 반응 기반 바이오센서
항원-항체 면역반응을 기반으로 하는 바이오센서는 반응의 선택성이 높고, 쉽게 구현할 수 있다는 이유로, 오랜 기간 사용되어왔다. s-swCNT FET를 응용한 바이오센 서 연구에도 사용되고 있는데, 항체의 크기가 너무 커서 (~10 nm) 항원과의 결합반응이 드바이 길이 외부(~0.7 nm, 10 mM PBS 사용 시)에서 일어나 FET를 신호변환기로 사용할 때 측정이 어렵다(드바이 스크리닝 효과, Debye screening effect)는 단점이 있다. 그럼에도, 항원-항체 기반의 s-swCNT FET는 지금까지도 사용되고 있는데, 이것은 항체의 3차원 구조와 방향성에 따라 결정된다.[참고문헌 2] 일반적으로 항체가 센서 표면에 고정되어 있다고 한다면, 결합 부분이 위쪽을 향하게 Y 모양으로 고정되는 것으로 생각하는데, 실제로는 Y 모양의 항체가 다양한 각도로 꺾여 서 고정되는 형태를 취한다. [그림 1]에서 볼 수 있듯이, 그중 일부 항체의 결합부위가 드바이 길이 내부로 들어오게 되어 반도체 소자의 신호변화에 기여하기도 한다. 최근 연구에서는 항체에서 결합 부위만을 남겨놓은 단일 도메인 항체(single domain antibody, sdAb)를 이용하거나, 분석물질과의 결합부위가 드바이 길이 내부에 들어오 도록 하기 위해 특수한 모양으로 제작된 항체를 사용하는 연구들이 소개되고 있다.[참고문헌 3,4] 이렇게 특수한 형태로 제작된 작은 크기의 항체들은 기존 정상 형태의 항체에 비해 높은 민감도로 분석물질을 측정할 수 있는 것으로 보고되고 있다.
3. 단백질-단백질 상호작용 기반 바이오센서
단백질-단백질 상호작용을 타깃 시스템으로 활용한 s- swCNT FET 바이오센서에서는 수용체 단백질(또는 올리 고 펩타이드)을 반도체 소자에 고정시키고, 타깃 단백질을 측정한다. 암, 심근경색 등, 특정 질병에 대한 조기진 단을 위한 바이오센서로의 응용이 대표적이며, 타깃 단백 질의 표면 전하 분포에 따라 반도체 신호의 크기가 변화 하는 방식으로 측정한다. 이때, 수용체 단백질(또는 올리 고 펩타이드)의 방향성에 따라, 결합되는 타깃 단백질의 방향성도 바뀌게 되는데, 이것이 반도체 신호의 변화 경 향성을 결정하게 된다.[참고문헌 5,6] 수용체의 구조에 따라, 타깃 단백질이 s-swCNT FET 소자의 드바이 길이 내부에 존재 하는 전하가 양전하 또는 음전하로 변화한다. 또는, 수용 체의 타깃 단백질과의 결합 부위가 가려진 입체장애 (steric hinderance) 효과를 보이는 경우, 측정이 되지 않는 경우도 있다. 이러한 현상은 무작위의 방향성으로 고 정된 수용체를 사용하는 경우에 발견되며, 대표적인 현상 으로는 (1)반도체 신호변화의 무경향성, (2)반도체 신호 변화 크기의 무경향성, (3)타깃 단백질 측정 불가가 있다.
실제로 저자 본인도, 동일한 실험을 반복하는데, 일정하지 않는 신호변화의 경향성으로 인해 많은 어려움을 겪었다. 이를 극복하기 위한 노력으로, 수용체 단백질의 특정 아 미노산에 결합 작용기를 붙여 사용하는 연구가 발표되었다[그림 2].[참고문헌 6] 이 연구에서는 수용체 단백질의 아미노산 서 열 중 특정 부위의 페닐알라닌(phenylalanine)을 페닐알 라닌 아자이드(phenylalanine azide)로 변형시켜 결합 작용기로 사용하였다. 총 3가지의 서로 다른 방향성을 갖 도록 디자인하고, 타깃 단백질의 측정에서 신호변화의 경 향성에 대하여 알아보았다. 그 결과, 결합 작용기가 고정된 수용체 단백질은 각각이 서로 다른 방향성으로 배향(orientation)되는 것을 확인하였고, 타깃 단백질의 측정에서 수용체 단백질의 방향성에 따라 반도체의 전도도 (conductance) 신호가 커지거나 작아지는 것을 확인하였다. 더욱이, 수용체 단백질의 결합 부위가 아래 방향으 로 향해서 입체장애 효과가 생기도록 디자인하고, 타깃 단 백질 실험에서 반도체의 전도도 신호가 변하지 않는 것을 확인하였다. 이를 통해, 수용체 단백질의 방향성을 조절 하는 것이, 바이오센서의 신호변화의 경향성을 일정하게 조절할 수 있고, 결과적으로, 더 우수한 센서를 제작할 수 있다는 것을 확인하였다.
4. 효소 활성 측정을 위한 바이오센서
효소 활성 측정을 위한 바이오센서에서는 효소의 반응 메커니즘에 따라 바이오센서 측정 메커니즘도 달라지게 된다. 일반적으로, 효소의 종류는 산화환원효소(Oxidore- ductase), 전이효소(transferase), 가수분해효소(hydro- lase), 분해효소(lyase), 이성질화효소(isomerase), 연결 효소(ligase)로 크게 6가지가 있다. [그림 3]은 분해효소 의 한 가지인, 핵산 중간 분해 효소(endonuclease)의 활 성 측정을 위한 s-swCNT FET 기반 바이오센서 연구를 보여주고 있다.[참고문헌 7] 이 연구에서는 핵산 중간 분해 효소의 기 질인 DNA를 센서 표면에 고정시켜 수용체이자 신호발생 단으로 사용하였다. 이때, 기질 DNA를 고정시키는 방향성에 따라 신호의 크기가 달라지는 것을 확인하였다. 핵산 중간 분해 효소가 분해하고 제거되는 DNA가 처음 고 정되었을 때, 센서 표면(드바이 길이 내부)에 얼마나 가까이 존재하였었는가에 따라 신호의 크기가 달라지는 것을 전도도 측정 실험과 컴퓨터 시뮬레이션을 통해 알아보았다. 반도체 소자의 전도도 신호 크기는 기질 DNA가 센서표면에 가까이 존재할 경우 커졌으며, 이를 만족시키기 위 해, 기질 DNA 말단에 메틸렌 블루(methylene blue)를 방향성 길잡이(orientation guide)로 사용하였다. 메틸 렌 블루는 s-swCNT 표면에 π-π 결합으로 잘 고정되 는 것이 알려져 있으며, 기질 DNA의 말단에 사용할 경우, 전체 DNA가 CNT 표면으로 이끌려와서 고정된다. 이후 타깃인 핵산 중간 분해 효소의 반응으로, 기질 DNA가 분리되면, 드바이 길이 내부의 음전하(DNA의 인산 작용기로 인한 음전하)가 적어지게 되고, 반도체 소자의 신호가 변화한다. 이 연구에서는 실험적으로 발견한 내용과 이를 바탕으로 진행한 컴퓨터 시뮬레이션의 결과가 서로 일치 하여, 제안한 측정 메커니즘이 실제로도 잘 작동하는 것을 검증하였다.
5. DNA 압타머 기반 바이오센서
DNA 압타머는 단백질, 저분자 화합물 등과 선택적인 결합을 하는 수십 개의 염기서열을 갖는 DNA로, 분석물 질과 결합할 때 3차원 구조가 바뀌는 것으로 알려져 있다. DNA 압타머는 기존의 항원-항체 반응에 비해, 타깃과의 결합반응이 FET 소자 근처에서 일어나기 때문에, 드바이스크리닝 효과를 극복할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, DNA 압타머의 3차원 구조 변화가 명확하지 않거나, 드바이 길이 내부에서의 전하변화가 없는(또는 적은) 경우 에는 신호의 크기가 작아서 센서로 사용하기 어렵다는 단 점이 있다. 따라서, 실험을 설계하는 단계에서 DNA 압타 머의 구조 변화에 대한 연구가 선행되어야 한다. DNA 압타머의 3차원 구조를 알아보기 위한 대표적인 방법으로 는 원편광 이색성 분석(circular dichroism spectroscopy, CD spectroscopy), 핵자기공명법(nuclear magnetic res- onance, NMR), 형광분광법(fluorescence spectroscopy) 이 있다[그림 4]. 이들 분석법은, DNA 압타머의 G-쿼드 라플렉스(G-quadruplex) 구조나, 헤어핀 구조(hairpin structure)에 대해 특징적인 피크, 또는 패턴을 보이고, 타깃과 결합하여 구조가 변하였을 때, 피크의 이동, 패턴 의 변화로 DNA 압타머의 구조가 변화한 것을 알 수 있다.[참고문헌 8] 또 다른 분석법으로는 X-선 흡수 분광법을 이용한 EXAFS(extended X-ray absorption fine structure), XANES(X-ray absorption near edge structure)를 사용하여 분석하기도 한다.[참고문헌 9,10] 3차원 구조의 변화가 확인 된 DNA 압타머는 센서 표면에 고정한 후 분석물질을 측 정하는데, 이때 신호변화를 극대화하기 위해, 부분적 상 보서열 DNA(partially complimentary DNA)를 결합 시키거나, s-swCNT 표면에 π-π 결합을 위해 만든 꼬리 부분의 DNA 길이를 조절하는 등, 다양한 방법을 사용 한다. 이와 같이, DNA 압타머를 이용한 s-swCNT FET 바이오센서는 높은 민감도, 드바이 스크리닝 효과의 극복, 높은 응용력 등의 장점이 있어, 차세대 FET 바이오센서로 각광받고 있다.
결 론
반도체 기반 바이오센서는 우수한 민감도와 높은 응용력, 소형화 가능성, 빠른 측정 시간, 비표지방식의 측정 등 다양한 장점을 가진 검출방식으로, 지금까지 꾸준한 발전이 이루어져왔으며, 최근 나노입자와 바이오물질 간의 상 호작용에 대한 심도 깊은 이해를 통해, 많은 연구자들이 기존의 센서가 갖는 한계를 극복하고자 노력하고 있다. 특별히, 바이오수용체의 3차원 구조, 분석물질과의 결합 방향성에 따른 신호변환기의 신호변화 경향성과 같은, s- swCNT FET 바이오센서의 신호 발생에 대한 근본적인 이해를 하려는 연구들이 많이 발표되고 있다. 다만, 다양한 형태(항원-항체 반응, 단백질-단백질 상호작용, 효소 활성 측정, DNA 압타머 활용 등)의 측정 메커니즘이 존재하고, 이들 각각의 측정 메커니즘을 최적화하기 위한 방 법 또한 서로 달라, 균일한 성장을 기대하기는 어렵다. 최근 연구에서는 이러한 한계점을 극복하고, 기존의 s- swCNT FET 기반 신호변환기의 성능을 향상시켜, 바이오센서를 상용화하려는 연구들도 발표되고 있다. 향후 s- swCNT FET 기반 바이오센서 연구가 실험실 수준을 벗어나, 임상 또는 일상생활에서 현장현시형 진단기기로 응용되는 것을 기대해 본다.
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김 명 은 Myungeun Kim
서울여자대학교 화학과, 학사(2018.3 - 2023.8)
서울여자대학교 화학과 석사과정(2023.9 - 현재, 지도교수 : 이창석)
이 창 석 Chang-Seuk Lee
순천향대학교 화학과, 학사(2007.3 - 2013.2)
순천향대학교 화학과, 석사(2013.3 - 2015.2, 지도교수 : 김태현)
순천향대학교 화학과, 박사(2015.3 - 2020.8, 지도교수 : 김태현)
순천향대학교 ICT환경보건시스템학과, 박사 후 연구원(2020.9 - 2021.8, 지도교수 : 김태현)
Queen Mary University of London, Department of Chemistry, Postdoctoral Research Assistant(2021.09 -2023.02, 지도교수 : Matteo Palma)
서울여자대학교 화학과 조교수(2023.3 - 현재)